背景

• 器官移植是终末期器官疾病重要治疗手段，术后感染影响患者预后
• 传统感染诊断方法有局限性，纳米孔测序技术有独特优势
• 制定共识推动纳米孔测序技术规范化应用

纳米孔测序技术的原理与特点

• 原理
  • 无需扩增样本，将DNA分子单链化，通过纳米孔，记录离子流变化并翻译碱基序列
• 特点
  • 读长优势：单次运行可读取超长序列，助于复杂基因组分析和病原体全基因组测序
  • 结构变异检测优势：超长读长利于识别复杂区域和大型结构变异，降低假阴性率
  • 快速、灵活适应临床需求：实时分析，数小时出结果，可调整测序深度，适用于多种样本

纳米孔测序技术的临床应用建议

• 术前评估
  • 供者器官检测：筛查病原体，评估移植风险，制定预防策略
  • 受者感染状态评估：了解潜在感染，为术后监测和预防提供依据
• 术后感染诊断
  • 血液感染
    • 菌血症与真菌血症：快速检测细菌和真菌核酸，鉴定病原体和耐药基因
    • 病毒血症：检测病毒核酸，确定种类和载量，监测治疗效果
  • 肺部感染
    • 细菌感染：检测病原体和耐药基因，精准选药
    • 病毒感染：快速检测多种病毒，分型和分析基因变异
    • 真菌感染：高灵敏度和特异性，了解耐药机制
  • 泌尿系统感染：检测病原体和耐药情况，调整治疗方案
  • 其他部位感染：应用于伤口、中枢神经系统、胃肠道等部位感染诊断
• 耐药监测：检测耐药基因，指导精准用药，监测耐药菌传播趋势

纳米孔测序技术的检测流程

• 样本处理
• 测序过程
• 结果解读

样本类型及要求

• 临床样本
  • 类型：血液、尿液、痰液等
  • 处理与保存：采集后尽快分装提取，DNA -20℃，RNA -80℃，无法立即提取按时间间隔存放
• 样本浓度及质量最低需求
  • DNA：纯度A260／A280为1.8，A260／A230为2.0 - 2.2；片段＞30kb；输入量至少1μg
  • RNA：避免化学杂质；纯度A260／A280接近2.0，A260／A230为2.0 - 2.2；评估完整性避免降解

样本保存及运输注意事项

• 24h内送达用冰袋，否则用干冰，送达后立即处理
• 无法提取时 -80℃保存，避免多次冻融

数据分析流程

• 数据生成与初步质控：实时生成分析，采集指标，去除低质量数据
• 数据比对与序列分析：比对参考基因组，识别关键区域，排除宿主DNA
• 物种及耐药基因鉴定：软件进行物种鉴定和耐药基因预测
• 与二代测序数据混合组装：利用长短读长优势，提升精度
• 使用规范化生信分析平台系统：确保数据处理一致，提高效率准确性

报告内容与结构

• 关键结果与描述：围绕关键结果，说明灵敏度和特异性
• 结构变异、大型插入或缺失以及致病突变：详细描述变异情况
• 病原微生物鉴定及耐药基因信息：包括物种、丰度、耐药基因等
• 致病性分析：评估变异致病性，提出治疗建议
• 报告附录：包含质控数据、参考文献和附加信息

解读与临床应用

• 微生物分类与致病性分级：分为致病、条件致病和定植微生物，综合评估条件致病微生物
• 未检测出病原微生物以及耐药基因或丰度稀少：结合其他检测判断真假阴性，分析假阴性原因
• 检测出过多病原微生物及耐药基因：去除低丰度物种，提高比对严格度

局限性与展望

• 局限性：技术准确性有误差，数据分析复杂，成本较高
• 展望：技术改进提高性能，生物信息学简化分析，降低成本促进应用